摘要

采用靜水實驗考察無菌和有菌條件下苯在不同埋深土壤中的自然降解規(guī)律，利用土柱實驗探究天然和人工馴化微生物對苯的去除規(guī)律，并通過高通量測序識別優(yōu)勢菌群。實驗結(jié)果表明：巖土菌懸液中的苯降解菌主要為紅球菌屬（Rhodococcus）；油污土菌懸液中苯降解菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）。靜水實驗結(jié)果表明，微生物的存在可提高苯去除率，但土壤埋深越深，苯的去除效果越差。土柱實驗結(jié)果表明：土壤對苯的吸附率約為77%，加入馴化微生物后，苯的去除率達到了84%~86%；天然微生物降解苯的貢獻率僅為2%，馴化微生物的加入使微生物對苯降解的貢獻率增大了3~4倍。

本工作通過靜水實驗分析了不同埋深的無菌和有菌土壤介質(zhì)對苯的自然降解規(guī)律，并通過土柱實驗探究天然和人工馴化微生物對苯的去除規(guī)律。為弄清微生物降解的潛力及生物強化修復(fù)的可行性，采取高通量測序手段分析微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為現(xiàn)場生物修復(fù)提供理論支撐。

1實驗部分

1.1試劑、材料和儀器苯：優(yōu)級純；HgCl2：分析純。 微生物菌種 ：分別取齊魯石化廠區(qū)附近200~300 m深度處的灰?guī)r及石油烴污染土壤（油污土）各200 g，粉碎后用無菌去離子水浸泡24 h，經(jīng)0.2 μm濾膜抽濾截留微生物，得到巖土菌種和油污土菌種。實驗土壤：采自廠區(qū)附近未受污染的可耕農(nóng)田，取土深度為0.5，1.0，1.5 m，分別記為淺層土、中層土、深層土。經(jīng)風(fēng)干、除雜、研碎后，過2 mm篩。滅菌實驗土壤：使用前將實驗土壤在121℃滅菌鍋中高溫滅菌30 min。地下水：采自當(dāng)?shù)匚词芪廴镜牡叵滤?，依?jù)《地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（HJ164—2020）［13］，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾去除懸浮顆粒物，4 ℃保存。滅菌地下水：使用前將地下水在121 ℃滅菌鍋中高溫滅菌20 min。含苯滲流液：采用m（甲醇）∶m（滅菌地下水）= 1∶100的甲醇-水溶液配制苯質(zhì)量濃度為20mg/L的苯-甲醇-水溶液。牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.4~7.6。無機鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4 4 g，KH2PO4 1.5 g，NH4Cl 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，NaNO3 1.0 g，MnSO4·5H2O 4.3 mg，ZnSO4·7H2O 4.3 mg，CuSO4·5H2O 4.0mg，CoCl2·6H2O 0.25 mg，去離子水1 000 mL，pH 7.4~7.6。營養(yǎng)液：按微生物生長所需的營養(yǎng)元素比例m（C）∶m（N）∶m（P）=100∶10∶1配制，其成分包括葡萄糖、NH4Cl、K2HPO4、NaCl等。HQ30D型水質(zhì)分析儀 ：美 國 HACH 公司；GI54TR型滅菌鍋：美國ZEALWAY公司；AIRTECH型超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；6890N/5975B型氣相色譜質(zhì)譜儀：安捷倫科技公司；UV-6000PC型紫外-可見分光光度計：惠普公司；TGL型高速離心機：上海器械廠。1.2實驗方法1.2.1苯降解菌的培養(yǎng)馴化在兩個500 mL 棕色廣口瓶中分別加入巖土菌種和油污土菌種，再加入牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基500 mL，密封在（25±1）℃恒溫條件下避光連續(xù)培養(yǎng)3 d，分別得到巖土菌種子液和油污土菌種子液。在兩個1 L的棕色微生物培養(yǎng)馴化瓶中各加入500 mL無機鹽培養(yǎng)基及作為唯一碳源的苯，再分別加入300 mL巖土菌種子液和油污土菌種子液，于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)［14］。7 d后取1 mL培養(yǎng)液測定苯質(zhì)量濃度。剩余培養(yǎng)液在3 000r/min下離心10 min后去除上清液，將底部沉淀物轉(zhuǎn)接至500 mL新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，再次加入苯。重復(fù)上述過程，在馴化過程中逐步提高苯濃度，直到苯質(zhì)量濃度從10 mg/L提高至20 mg/L。穩(wěn)定培養(yǎng)2周，得到巖土菌懸液及油污土菌懸液。1.2.2微生物降解苯的靜水實驗分別取20g不同取樣深度的實驗土壤，置于100 mL滅菌玻璃瓶內(nèi)，加入含苯地下水溶液80mL，封口后15 ℃避光靜置，各設(shè)置3組平行樣。按相同方法設(shè)置無菌對照組：采用滅菌實驗土壤，加入0.02 mg/L HgCl2作為抑菌劑。分別在不同降解時間取樣，每次抽取0.5 mL上清液測定苯的質(zhì)量濃度，并測定溶液的氧化還原電位（ORP）。1.2.3垂直入滲條件下微生物降解苯的土柱實驗土柱實驗裝置示意見圖1。有機玻璃柱（長30cm，內(nèi)徑5 cm）用紫外燈滅菌30 min。在柱內(nèi)由下至上分別裝填等質(zhì)量的不同取土深度（1.5，1.0，0.5 m）處的3種實驗土壤，柱兩端各裝填1 cm厚度的石英砂。

分別設(shè)計4組土柱實驗（A，B，C，D組），每組各3個土柱作為平行樣。A，C，D組中填充滅菌實驗土壤，B組填充實驗土壤。各土柱用無菌去離子水飽水24 h后從柱頂通入含苯滲流液。其中A組的含苯滲流液中加入0.02 mg/L HgCl2作為抑菌劑，B，C，D組加入營養(yǎng)液［15］。C和D兩組分別緩慢注入10 mL油污土菌懸液及巖土菌懸液。實驗過程中維持流出液流量為5.2~5.5 mL/h，定期收集并測定流出液中苯的質(zhì)量濃度和ORP值。1.3分析方法苯質(zhì)量濃度的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：DB-5毛細(xì)管柱；載氣為He氣，流量1 mL/min，分離比5∶1；進樣溫度為250 ℃；升溫程序起始溫度為40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的升溫速率升至300 ℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30~500 m/z。馴化得到的苯降解菌的高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。 土壤有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法（HJ 615—2011）［16］。 溶液ORP的測定采用水質(zhì)分析儀。

2結(jié)果與討論

2.1苯降解菌的種類通過高通量測序得到巖土和油污土菌懸液中微生物的豐度，見圖2。由圖2可見：從巖土中馴化出的苯降解菌主要來自不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas），其中紅球菌屬的微生物豐度最高；油污土菌懸液中包含了不動桿菌屬（Acinetobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的微生物，其中假單胞菌屬的微生物占有較高的豐度。有報道表明，假單胞桿菌和不動桿菌是環(huán)境中非常重要的兩類降解菌［17］。

2.2靜置條件下苯的降解效果靜水實驗中苯質(zhì)量濃度的變化見圖3。由圖3可見：實驗運行的第1天，無菌和有菌條件下苯的質(zhì)量濃度即出現(xiàn)明顯差異，無菌條件下含不同深度實驗土壤的地下水中的苯質(zhì)量濃度從20 mg/L降至10 mg/L左右，而有菌條件下苯的質(zhì)量濃度從20 mg/L降到8 mg/L左右；隨著時間的延長，有菌和無菌條件下苯濃度降低趨勢的差異更加顯著，無菌條件下呈現(xiàn)輕微下降的趨勢，而有菌條件下則顯著降低，如無菌條件下淺層土中苯質(zhì)量濃度在30 d內(nèi)由10 mg/L僅降到9 mg/L，而有菌條件下由8 mg/L顯著降低至2 mg/L，這說明除吸附過程外，微生物對苯的去除起到了重要作用；有菌條件下淺層土、中層土、深層土的苯質(zhì)量濃度在第30天分別為2.1，2.4，3.7 mg/L，苯去除率分別為89%，88%，82%，較無菌環(huán)境下的苯去除率（53%，52.5%，50%）提高了約30百分點；并且埋深越深的土壤介質(zhì)對水溶液中苯的去除率越低，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，原因可能是深層土中有機質(zhì)含量相對較少，約為3.83%（表1），供給微生物生長的養(yǎng)分不足，使得微生物對苯的降解效果減弱［18］。

ORP可以反映出好氧微生物對石油烴的降解性能［19］。靜水實驗中ORP的變化見圖4。由圖4可見，無菌條件下反應(yīng)液的ORP在30 d內(nèi)均維持在225mV左右；在有菌條件下，反應(yīng)液的ORP有明顯的下降趨勢，第9天時ORP降低到200 mV以下，最終維持在160 mV左右。苯提供了充足的碳源，微生物降解苯的過程中消耗了溶解氧，ORP隨之降低。但隨著溶液中苯濃度的降低，生物降解速度變緩，ORP又逐漸趨于穩(wěn)定［20］。

2.3垂直入滲條件下苯的降解效果土柱實驗中苯質(zhì)量濃度的變化見圖5。由圖5可見：4個土柱流出液中苯的質(zhì)量濃度均在18 d后達到相對穩(wěn)定；裝有滅菌土的A柱主要是對苯的吸附效果進行研究，流出液中苯的質(zhì)量濃度在第18天達到最高值，約為4.6 mg/L，苯去除率為77%；含有微生物的B柱、C柱、D柱的流出液苯質(zhì)量濃度均在第22天達到最高值，苯去除率為79%~86%。

土柱中苯降解貢獻率分析表見表2。由表2可見：不含微生物的A柱對苯的最低去除率為77%，可代表實驗土壤對苯的吸附量，設(shè)定此時吸附對苯去除的貢獻率為100%；含有天然微生物的B柱是土壤吸附和天然微生物降解協(xié)同去除苯，在穩(wěn)定階段苯的去除率為79%，其中生物降解的貢獻率約為2%（以A柱數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)折算，下同）；加入不同來源馴化微生物的C柱和D柱是采用土壤吸附和生物強化降解苯，在穩(wěn)定階段苯的最低去除率分別為86%和84%，其中生物降解的貢獻率分別為9%和7%，較存在天然微生物的B柱提高了3~4倍。從分析結(jié)果來看，自然環(huán)境中含有苯降解菌，但其豐度較低，導(dǎo)致了生物降解作用所占的比重偏低，苯的自然降解緩慢；加入馴化的微生物后，生物降解的貢獻率有所提高。在降解污染物時，混合菌種往往比單一菌種更為有效，能夠充分發(fā)揮各菌種之間的協(xié)同作用［21］。因此，還需要進行長時間的自然選擇和馴化，才會使生物降解在土壤介質(zhì)內(nèi)的作用進一步增強。

土柱實驗中ORP的變化見圖6。由圖6可見：隨降解時間的延長，ORP總體呈下降趨勢；其中，加入馴化降解菌的C柱和D柱的流出液的ORP值均較低，最終維持在150~200 mV，其原因是添加的微生物在生物降解過程中需消耗溶解氧，ORP隨之降低，進而整個體系的氧化性降低。

3結(jié)論

a）含有微生物的土壤在30 d內(nèi)對地下水中苯的去除率可達到80%以上，較無菌環(huán)境下苯的去除率提高了30百分點。地下水中苯的去除率與土壤的埋深呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。b）進入含水層中的苯容易被土壤所吸附。在土柱滲流系統(tǒng)中，苯的吸附去除約占77%；吸附和天然微生物協(xié)同作用對苯的去除率約占79%；加入馴化微生物后，苯的去除率達到了84%~86%。c）天然微生物對苯降解的貢獻率約為2%。加入馴化微生物后，微生物的生物降解貢獻率可提高3~4倍。其中，紅球菌（Rhodococcus sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.）等好氧菌是石油污染場地降解苯的主要微生物。文章來源：環(huán)保未來

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