CRISPR-Cas核酸酶是目前最為廣泛使用的基因編輯工具，在基礎(chǔ)科研以及臨床應(yīng)用方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。除脫靶活性以外，CRISPR-Cas核酸酶編輯基因組可能產(chǎn)生染色體易位以及染色體大片段缺失等異常結(jié)構(gòu)，這將嚴(yán)重威脅基因組的穩(wěn)定性，并與癌癥的發(fā)生相關(guān)。因此染色體結(jié)構(gòu)異常成為CRISPR-Cas應(yīng)用的一大障礙。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NIH于2021年在Nature上撰文強(qiáng)烈呼吁關(guān)注基因編輯過程中染色體結(jié)構(gòu)異常的產(chǎn)生，并尋求領(lǐng)域內(nèi)研究者開發(fā)相應(yīng)的檢測(cè)方法1。最近美國(guó)FDA暫停了AllogeneTherapeutics開發(fā)的CAR-T細(xì)胞療法的臨床研究，原因是在一例患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了由基因編輯導(dǎo)致的可能引發(fā)癌癥發(fā)生的染色體易位。染色體結(jié)構(gòu)異常在基因編輯過程中的發(fā)生概率僅百分之幾，屬于基因編輯中的小概率事件，然而隨著基因編輯臨床應(yīng)用的不斷普及，被編輯細(xì)胞出現(xiàn)不可控染色體易位等的病人的數(shù)量也必然會(huì)將逐漸增加。而由于缺乏針對(duì)基因編輯過程中染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生機(jī)制的了解，領(lǐng)域內(nèi)尚沒有抑制該類副產(chǎn)物發(fā)生的有效策略。

2022年3月8日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志課題組及合作者在Nature Communications上發(fā)表了題為Cas9 exo-endonucleaseeliminates chromosomal translocations during genome editing的研究文章，揭示了基因編輯過程中染色體易位產(chǎn)生的分子機(jī)制，并針對(duì)性地設(shè)計(jì)和開發(fā)了安全性大幅提高的新型基因編輯酶Cas9TX。Cas9TX能抑制基因編輯過程中染色體易位、大片段缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常的產(chǎn)生，將CRISPR-Cas9基因編輯的安全性大大提高，其編輯過程中的DNA損傷被降低到與目前被認(rèn)為最安全的堿基編輯器（Base Editor）相當(dāng)?shù)乃?。Cas9TX可能是目前最為安全的CRISPR-Cas9編輯變體。

基于胡家志課題組2019年開發(fā)的全面評(píng)估基因編輯安全性的方法PEM-seq (Primer-extension-mediated sequencing)2，作者首先評(píng)估了新一代CAR-T技術(shù)的安全性。PEM-seq方法的詳細(xì)操作指南也于2022年公開發(fā)表于Cell系列的雜志STAR protocols上(。新一代CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建結(jié)合了基因編輯技術(shù)，在生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的同時(shí)敲除TRAC，B2M，PDCD1等多個(gè)基因，可降低供體與受體之間的免疫排斥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)異體移植的可能，并同時(shí)提高CAR-T細(xì)胞的殺傷能力。在本研究中，作者首先利用PEM-seq檢測(cè)了新一代CAR-T細(xì)胞中染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生概率，分析表明染色體易位普遍發(fā)生于多個(gè)Cas9的靶向位點(diǎn)之間，其比例占到了總編輯事件的1%左右。這意味著在CAR-T細(xì)胞療法中，每給病人回輸10^8個(gè)CAR-T細(xì)胞便有多于10^6個(gè)細(xì)胞攜帶染色體易位。而值得注意的是，以往的關(guān)于淋巴瘤的研究表明，TRAC附近存在可以大幅促進(jìn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，可以提升易位后附近原癌基因的表達(dá)水平（如北京大學(xué)吳虹教授最近發(fā)表的工作：）4。該研究進(jìn)一步指出目前領(lǐng)域內(nèi)常用于消除脫靶活性的Cas9高保真變體并不能有效抑制Cas9靶向位點(diǎn)之間染色體易位的發(fā)生（圖一）。

圖一. 染色體易位普遍存在于新一代CAR-T細(xì)胞制作過程中

為了探究基因編輯過程中染色體易位發(fā)生的規(guī)律，該研究對(duì)PEM-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的分析，作者意外地發(fā)現(xiàn)Cas9靶向位點(diǎn)與脫靶位點(diǎn)兩端發(fā)生的易位連接存在著明顯的方向偏好性（bias）。按理DNA發(fā)生切割后兩種末端應(yīng)該是隨機(jī)結(jié)合的，不具有偏好性，而實(shí)際上的末端結(jié)合偏離了理論值1:1的比例（圖二上）。通過這樣一個(gè)“真奇怪”的發(fā)現(xiàn)（注：艾薩克阿西莫夫曾說，在科學(xué)探索中能聽到的最激動(dòng)人心、可能預(yù)示著新發(fā)現(xiàn)的一句話，不是“我找到了”，而是“真奇怪”。），作者找到了基因編輯過程中染色體易位大量發(fā)生的主要原因之一，即Cas9在靶位點(diǎn)和脫靶位點(diǎn)上的反復(fù)切割（repeated cleavage）（圖二下）。這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)也解決了困擾Fred Alt等實(shí)驗(yàn)室近十年之久的一個(gè)問題：為何G1晚期的細(xì)胞比生長(zhǎng)中的細(xì)胞更容易形成染色體易位？

圖二. Cas9反復(fù)切割完美修復(fù)產(chǎn)物導(dǎo)致了染色體易位的大幅度產(chǎn)生

隨后作者嘗試將核酸外切酶與Cas9相偶聯(lián)，通過在編輯過程中修飾DNA斷裂末端來減少完美修復(fù)產(chǎn)物的比例，從而抑制Cas9反復(fù)切割（圖二下）。通過對(duì)多種外切酶的篩選，本研究最終將優(yōu)化過的人源TREX2蛋白與Cas9相偶聯(lián)生成核酸內(nèi)外切酶Cas9TX，PEM-seq分析顯示Cas9TX確實(shí)可以抑制Cas9反復(fù)切割，并幾乎消除了染色體易位的產(chǎn)生。接著作者通過全基因測(cè)序等手段驗(yàn)證了Cas9TX并不會(huì)對(duì)基因組造成非特異性的切割，它可以穩(wěn)定、有效地抑制消除染色體易位的產(chǎn)生，并達(dá)到了與造成DNA單鏈斷裂的堿基編輯器同等的水平。另外研究人員發(fā)現(xiàn)Cas9TX還可大幅度減少染色體大片段缺失的生成。與此同時(shí)，在抑制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常發(fā)生的同時(shí)，Cas9TX還能保持與Cas9同水平或者略高的基因編輯水平。另值得指出的是，突變的TREX2僅236個(gè)氨基酸，不會(huì)顯著增加Cas9的大?。▓D三）。

圖三. Cas9TX幾乎消除了基因編輯過程中染色體易位的產(chǎn)生

作者進(jìn)一步將Cas9TX應(yīng)用于新一代CAR-T細(xì)胞的制備，發(fā)現(xiàn)在不影響CAR-T殺傷效果的同時(shí)，Cas9TX將靶向位點(diǎn)之間的染色體易位降低到了背景水平?？傊?，Cas9TX展現(xiàn)出了驚人的效果。

圖四. Cas9TX提高CAR-T細(xì)胞制作的安全性

北京大學(xué)、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志研究員為該文章的通訊作者。該研究得到了北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部劉濤，北京大學(xué)、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心李湘盈，北京大學(xué)魏平研究員以及北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)兒童醫(yī)院婦科肖冰冰醫(yī)生的大力支持。胡家志研究員實(shí)驗(yàn)室博士研究生尹健行，盧如森以及辛昌昌為該文章的共同第一作者，該文章也得了其他共同作者的大力幫助。該工作得到了科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心以及北京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)+X 專項(xiàng)科研基金的資助。

參考文獻(xiàn)

3. Yang Liu, J. Y., Tingting Gan, Mengzhu Liu, ChangchangXin, Weiwei Zhang, and Jiazhi Hu. PEM-seq comprehensively quantifies DNA repairoutcomes during gene-editing and DSB repair.STAR Protocols3, doi: (2022).